柱色谱有分配色谱和吸附色谱两种。分配色谱原理是溶质分子在两种不同混溶的液相即固定相和流动相之间按照它们的相对溶解度进行分配。吸附色谱其原理是利用混合物中各组分在固定相上的吸附能力和流动相的解吸能力不同，让混合物随流动相流过固定相，发生了反复多次的吸附和解吸过程，从而使混合物分离成两种或多种单一的纯组分。柱层析中通常是吸附色谱。
在用柱色谱分离混合物时，将已溶解的样品加入到已装好的色谱柱顶端，吸附在固定相（吸附剂）上，然后用洗脱剂（流动相）进行淋洗，流动相带着混合物的组分下移。样品中各组分在吸附剂上的吸附能力不同，通常来说，极性大的吸附能力强，极性小的吸附能力相对弱一些。且各组分在洗脱剂中的溶解度也不一样，而被解吸的能力也就不同。非极性组分由于在固定相中吸附能力弱，首先被解吸出来，被解吸出来的非极性组分随着流动相向下移动与新的吸附剂接触再次被固定相吸附。随着洗脱剂向下流动，被吸附的非极性组分再次与新的洗脱剂接触，并再次被解吸出来随着流动相向下流动。而极性组分由于吸附能力强，因此不易被子解吸出来，随着流动相移动的速度比非极性组分要慢得多（或根本不移动）。这样经过反复的吸附和解吸后，各组分在色谱柱上形成了一段一段的层带，若是有色物质，可以看到不同的色带。随着洗脱过程的进行从柱底端流出。每一色带代表一个组分，分别收集不同的色带，再将脱洗剂蒸发，就可以得到单一的纯物质。
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柱层析关键在于柱子是否装好和淋洗剂是否选择恰当。而淋洗剂的选择是通过TLC确定。TLC的作用除了跟踪反应进程，检测试剂和原料纯度外，一个重要的用途就是为柱层析选择适当的淋洗剂。
目标产物的Rf值在0.2～0.3左右时，通常淋洗剂是采用TLC分析得到的展开剂的比例再稀释一至两倍后的溶剂。由于层析柱和薄板不同，即使两者使用的硅胶都相同，但是在把TLC分析得到的展开剂用在柱层析时，也显得极性偏大，所以要稀释，但又不能稀释太多，否则成了靠扩散作用来分离，效果也不会好。
需要注意的是：某种样品在这种展开剂中只显示一个点，并不等于在别的展开剂中也只显示一个点。因此在寻找展开剂时，多尝试几种比例不同，成分不同的展开剂。展开剂的极性太小，点分不开，极性太大，也分不开，通常以目标产物的Rf值在0.3-0.5为。点不能点得太浓，否则容易重叠不易判断，因为如果两个点相近的话，一浓就变成一个点了。板上点的展开的清晰程度和溶剂的极性和物质在该溶剂中的溶解性有关，只有两者比较合适才能有一个较好的分离效果。
选择适当的展开剂是首要任务，通常常用溶剂按照极性从小到大的顺序排列大概为：石油醚<环已烷<<甲苯<苯<二氯甲烷<氯仿<**<乙酸乙酯<正丙醇<乙醇<甲醇<水，单纯的展开剂通常不能达到很好的分离效果，往往使用混合溶剂。通常使用一个高极性和低极性溶剂组成的混合溶剂，高极性的溶剂还有增加区分度的作用，常用的溶剂组合有：石油醚/乙酸乙酯，石油醚/丙酮，石油醚/**，石油醚/二氯甲烷，乙酸乙酯/甲醇，二氯甲烷/乙酸乙酯，二氯甲烷/甲醇，氯仿/乙酸乙酯。丙酮，甲醇等溶剂需注意含水量，如含水较多可用无水等干燥剂处理，氯仿需使用无水氯化钙除去1％的醇。
展开剂的比例要靠尝试。很多时候，展开剂的选择要靠自己不断变换展开剂的组成来达到效果。通常把两种溶剂混合时，采用高极性/低极性的体积比为1/2-3的混合溶剂，如果有分开的迹象，再调整比例，达到效果，如果没有分开的迹象，是换溶剂。有些时候展开剂中加入少量的酸碱物质（乙酸、三乙胺、氨水）会起到很好的分离效果。
用TLC判断物质的纯度与含量时，往往要和其它分析手段相结合，因为某种样品在这种展开剂中只显示一个点，并不等于在别的展开剂中也只显示一个点。产品点检测要更多地使用显色剂，如果仅用紫外灯，会损失较多产品，紫外的灵敏度通常比显色剂低1-2个数量级。显色剂的使用与配制见附1。
装柱通常分为湿法和干法两种，无论干法还是湿法，固定相的上表面一定要平整，并且固定相的高度通常为15㎝左右，太短了可能分离效果不好，太长了也会由于扩散或拖尾导致分离效果不好。干硅胶的视密度在0.4左右，所以要称40g硅胶，用烧杯量100ml也可以。如果样品量在100mg以下，则可以考虑使用附2所述方法，使用薄层层析硅胶。
湿法装柱柱效比较高，适合分离少量的比较难分离的物质，通常使用200～300目的硅胶，颗粒比较粗的硅胶（200目以下）因为不易调成糊状，所以不适合湿法装柱。
在清洁干燥的层析柱（无砂芯柱）下端放置少量脱脂棉，再铺约0.5㎝厚的石英砂或铺平，然后进行装柱。将吸附剂（氧化铝或硅胶）用洗脱剂中极性zui低的洗脱剂调成糊状，在柱内先加入约3/4柱高的洗脱剂，再将调好的吸附剂边敲边倒入柱中，同时，打开下旋活塞，在色谱柱下面放一个干净并且干燥的锥形瓶或烧杯，接收洗脱剂。当装入的吸附剂有一度高度时，洗脱剂下流速度变慢，待所用吸附剂全部装完后，用流下来的洗脱剂转移残留的吸附剂，并将柱内壁残留的吸附剂淋洗下来。在此过程中，应不断敲打色谱柱，以使色谱柱填充均匀并没有气泡。柱子填充完后，在吸附剂上端覆盖一层约0.5cm厚的石英砂或。覆盖石英砂或的目的是：a使样品均匀地流入吸附剂表面；b当加入洗脱剂时，它可以防止吸附剂表面被破坏。在整个装柱过程中，柱内洗脱剂的高度始终不能低于吸附剂zui上端，否则柱内会出现裂痕和气泡。
干法装柱是指将干的固定相直接倒入层析柱中，也可以先在层析柱中加入3/4的洗脱剂，然后倒入固定相。干法装柱快速便捷，分离混合物时如无特殊要求通常采用干法。EI
干法快速装柱通常如下操作。在清洁干燥的层析柱（无砂芯柱）下端放置少量脱脂棉，将液体出口覆盖，脱脂棉要压紧且上端平整，也可加入石英砂或使其平整。一次性加入层析需要的所有硅胶，然后再轻轻敲打柱子，至硅胶界面平整且不再下降为止。然后用真空泵直接抽，可以间断的开启关闭活塞，使硅胶更密实。
干法装柱后要用洗脱剂平衡装好的层析柱，通常用低极性的洗脱剂淋洗至溶剂于硅胶之间吸附放热现象消失为止，这一点尤其在待分离物质极性比较小和对热敏感的时候非常重要。
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上样也有干法和湿法之分。
干法就是把待分离的样品浓缩后用少量溶解度较好的溶剂溶解后，在加入刚好可以吸附溶剂量的硅胶，拌匀后再旋蒸去溶剂。如此得到的粉末再小心加到柱子的顶层。干法上样较麻烦，但可以保证样品层平整。需要注意的是硅胶的用量，硅胶用量太大，样品量变多，不利于样品的分离；硅胶用量太少，如遇溶解度差的产品会堵塞整个层析柱，导致流速变慢甚至不流。硅胶用量通常规则：①液体样品，称2-3倍于上样量的硅胶用于吸附样品，称10-25倍于上样量的硅胶用于填充固定相；②油状样品，称1.5-2倍于上样量的硅胶用于吸附样品，称10-25倍于上样量的硅胶用于填充固定相；③固体样品，称1-1.5倍于上样量的硅胶用于吸附样品，称10-25倍于上样量的硅胶用于填充固定相；如果极难分，也可以用50-100倍量的硅胶装柱。
湿法上样就是用少量溶剂（就是展开剂，如果展开剂的溶解度不好，则可用一极性较大的溶剂，但必须少量）将样品溶解后，再用胶头滴管转移得到的溶液，沿着层析柱内壁均匀加入。然后用少量淋洗剂洗涤后，再加入。湿法较方便，少量样品通常采用此法。
淋洗剂是将分离物从吸附剂上洗脱下来所用的溶剂，所以也称为洗脱剂或简称溶剂。其极性大小和对被分离物各组分的溶解度大小对于分离效果非常重要。如要淋洗剂的极性远大于被分离物的极性，则淋洗剂将受到吸附剂的强烈吸附，从而将原来被吸附的待分离物“顶替”下来，随多余的淋洗剂冲下而起不到分离作用；如果淋洗剂的极性远小于各组分的极性，则各组分被吸附剂强烈吸附而留在固定相中，不能随流动相向下移动，也不能达到分离的目的。如要淋洗剂对于被分离物各组分溶解度太大，被分离物将会过多、过快地溶解于其中并被迅速洗脱而不能很好地分离；如果溶解度太小，则会造成谱带分散，甚至不能分开。常用溶剂的极性大小次序也因所用吸附剂的种类不同而不尽相同，初步确定后再上柱分离。如要所有色带都行进甚慢则应改用极性较大溶解性能也较大的溶剂，反之则改用极性和溶解性都较小的溶剂，直至获得满意的分离效果。
除了分离效果外还应当考虑：①在常温至沸点的温度范围内可与被分离物长期共存不发生任何化学反应，也不被吸附剂或被分离物催化而发生自身的化学反应；②沸点较低以利回收；③毒性较小，操作安全；④适当考虑价格是否合算，来源是否方便；⑤回收溶剂通常不应作为zui终纯化产物的淋洗剂。
淋洗剂的用量往往较大，故使用单一溶剂以利回收。只有在选不出合适的单一溶剂时才使用混合溶剂。混合溶剂通常由两种可以无限混溶的溶剂组成，先以不同的配比在薄层板上试验，选出配比，再按该比例配制好，像单一溶剂一样使用。如要必须在层析过程中改变淋洗剂的极性，不能把一种溶剂迅速换成另一种溶剂，而应当将极性稍大的溶剂按一定的百分率逐渐加到正在使用的溶剂中去，逐步提高其比例，直至所需要的配比。一条经验规律称为“幂指数增加”，例如，原淋洗剂为环己烷，如欲加入二氯甲烷以增加其极性，则不应立即换为二氯甲烷，而应使用这两种溶剂的混合液，其中二氯甲烷的比例依次为5%，15%，45%，zui后再换为纯净的二氯甲烷。每次加大比例后，须待流出液量为吸附剂装载体积的3倍时再进一步加大比例。这只是通常方法，其目的在于避免后面的色带行进过快，追上前面的色带，造成交叉带。但如果两色带间有很宽阔的空白带，不会造成交叉，则亦可直接换成后一种溶剂，所以应根据具体情况灵活运用。
柱层析实际上是在扩散和分离之间的权衡。太低的洗脱强度并不好，推荐用梯度洗脱。通常情况下收集的情况如下：10mg上样量，1g硅胶，0.5ml收一馏分；1-2g上样量，50g硅胶，20～50ml收一馏分。具体情况要看待分离的物质决定，附2文有一定参考价值。
