技术快报---Nanolive实时无标记断层扫描3D成像技术揭示病毒诱导的细胞病理反应机制

细胞病变效应（CPE）是指病毒对组织培养细胞侵染后产生的细胞变性，是感染的标志。CPE可通过相差显微镜或荧光显微镜观察，但会产生光毒性，此次研究我们通过Nanolive数字全息断层显微术（DHTM）具有的最小干扰的方式揭示活细胞中病毒感染的模式。DHTM通过无标记的方式记录低剂量的光通过透明样本表面的相差位移。DHTM基于折射率（RI）推断3维（3D）断层图像。通过测量RI和计算折射率梯度（RIG）值，DHTM在光学上揭示细胞在病毒感染时的异质性。我们发现痘苗病毒（VACV）、单纯疱疹病毒（HSV）和鼻病毒（RV）感染，RIG逐渐明显增加。VACV，而不是HSV和RV感染引起细胞体积变化，但三种病毒都会改变细胞质膜动力学和诱导凋亡特征类似于化学复合物癌基因抑活药，具毒特异性特征。

实验过程

用带GFP标签的VACV病毒感染hela细胞，之后通过Nanolive 全息3D显微镜对感染早期到后期的细胞，非感染的细胞、阿糖胞苷处理的感染与非感染的细胞分别成像（2小时到8小时），记录细胞折射率（RI）变化过程并标成伪彩。

1. 对感染和非感染细胞感染早期和感染8小时成像，RI分析发现细胞感染8小时折射率梯度增加了3倍，而非感染的细胞，折射率梯度没有改变，如下图所示。

2. 感染细胞、非感染细胞，阿糖胞苷处理的感染细胞，对不同时间点分别成像，分析折射率梯度变化，阿糖胞苷处理的感染细胞折射率仅增加了1.3倍，因阿糖胞苷会抑制VACV晚期基因的表达，该数据揭示细胞折射率梯度的改变主要由VACV晚期基因表达引起；且阿糖胞苷处理的感染细胞早期产生的滤泡比未处理的感染细胞多，后期和非处理的细胞没有明显的差别。

3.星形孢霉素诱导细胞凋亡的折射率变化：0-4小时，折射率梯度逐渐增加，5小时后略有减少。

4. 通过Nanolive全息3D成像技术，测量了不同处理细胞的体积大小，发现因细胞体积的变化，导致细胞质浓度增加，引起了细胞折射率梯度变化，从而全面揭示了病毒感染引起的细胞病变的效果及过程。

总之，我们引入的DHTM技术实现了感染性研究的无标记定量分析，对活细胞以最小感染的方式揭示了病毒类型特异性变化及细胞病变。

经典的视频增强型相差光学显微镜，如干涉显微镜和亮场显微镜因衍射极限导致图像不均匀，缺乏断层信息和聚焦依赖的结构膨胀，相反，DHTM可以延长定量时间分辨的3D图像，通过低功率的激光（520nm,一级，0.2mW/mm2），不会在高时间和空间分辨率下产生光毒性。

总结：

Nanolive 的全息断层3D成像技术优于经典光学技术，如层析相显微镜和衍射相显微镜，Nanolive不但高灵敏度、高精度，且采用非侵入性检测。系统可在高空间和时间分辨率上获得定量的3D信息。且可很容易地测量细胞体积及亚细胞结构，还可以用于获取两个新维度的细胞数据：RI及RIG,这是其他显微成像系统不能评估的。这个算法*，解决了活细胞病理成像的一系列技术限制，包括通过化学物或遗传编码的荧光素标记细胞及病毒，成像过程中的光毒性等。非侵入性与低侵入性的Nanolive 全息断层3D成像技术采用低功率激光，为活细胞研究提供了一个的适用工具。

Nanolive 3D显微成像技术病毒感染及药物研究优势：

﹡非侵入式或无需染色标记；

﹡实验处理低于5分钟；

﹡实时监测细胞特性；

﹡断层扫描---96重Z轴堆叠；

﹡任意的数字染色高达9色；

﹡纳米级分辨率；

﹡2秒钟快速3D全息成像；

﹡无标记IHC,IF组织学与细胞学研究；

﹡整合3通道荧光，同时10色标记，完整活细胞解决方案；