质谱的联用技术

7.1 气质联用（GC-MAS）

7.1.1 概述

迄今为止，人们所认识的化合物已超过1000万种以上，而且新的化合物仍在快速地增长，体系的分离和检测已成为分析化学的艰巨任务。

气相色谱（Gas chromatography，GC）具有的分离能力，但它对未知化合物的定性能力较差；质谱（Mass Spectrometry，MS）对未知化合物具有的鉴定能力，且灵敏度，但它要求被检测组分一般是纯化合物。将GC与MS联用，彼此扬长避短，既弥补了GC只凭保留时间难以对复杂化合物中未知组分做出可靠的定性鉴定的缺点，又利用了鉴别能力很强且灵敏度的MS作为检测器，凭借其高分辨能力、高灵敏度和分析过程简便快速的特点，GC-MS在环保、医药、农药和等领域起着越来越重要的作用，是分离和检测复杂化合物的力工具之一。

7.1.2 GC-MS联用技术的原理

7.1.2.1 联用技术原理概述

质谱法的基本原理是将样品分子置于高真空（<10^-3Pa）的离子源中，使其受到高速电子流或强电场等作用，失去外层电子而生成分子离子，或化学键断裂生成各种碎片离子，经加速电场的作用形成离子束，进入质量分析器，再利用电场和磁场使其发生色散、聚焦，获得质谱图。根据质谱图提供的信息可进行有机物、无机物的定性、定量分析，复杂化合物的结构分析，同位素比的测定及固体表面的结构和组成等分析。

气相色谱法是一种以气体作为流动相的柱色谱分离分析方法，它可分为气-液色谱法和气-固色谱。作为一种分离和分析有机化合物有效方法，气相色谱法特别适合进行定量分析，但由于其主要采用对比未知组分的保留时间与相同条件下标准物质的保留时间的方法来定性，使得当处理复杂的样品时，气相色谱法很难给出准确可靠的鉴定结果。

    气-质联用(GC—MS)法是将GC和MS通过接口连接起来，GC将复杂混合物分离成单组分后进入MS进行分析检测。

7.1.2.2GC-MS系统的组成

气质联用仪是分析仪器中较早实现联用技术的仪器。自1957年J.C.Holmes和F.A.Morrell实现气相色谱和质谱的联用以后，这一技术得到了长足的发展。在所有的联用技术中GC-MS联用技术发展完善，应用泛。GC-MS联用系统的一般由下图所示的各部分组成：

GC-MS联用仪的组成示意图

气相色谱仪分离样品中各组分，起着样品制备的作用；接口把气相色谱流出的各组分送入质谱仪进行检测，起着气相色谱和质谱之间适配器的作用；质谱仪对接口依次引入的各组分进行分析，成为气相色谱仪的检测器；计算机系统交互式地控制气相色谱、接口和质谱仪，进行数据采集和处理，是GC-MS的控制单元。

下图是气相色谱分析的概述。它显示，混合物由一股气流（流动相，又称气相）携带通过一根长长的内壁涂有薄薄的一层液膜（液态固定相）的毛细柱。因为混合物的不同组分与固定相的结合能力不同，因此在柱的末端混合物中的各个组分会逐个的出来（洗脱）而达到分离的目的。

在一个简单的气相色谱装置中，这些被逐次洗脱出来的组分或者被某种火焰燃烧以便于检测（通用火焰离子化检测器， FID），或者穿过某种其他的检测器后放入大气。在气相色谱中，这些组分在色谱图中是以峰的形式来记录。有关组分的信息通过测量色谱图中该组分峰的峰高和峰面积来确定。这些对应着检测到的组分量以及该组分通过毛细柱的时间。色谱图上某个组分峰点对应的时间（以进样作为时间起点）被成为保留时间。通常利用该组分的特定保留时间对其定性，但这种定性方式并不准确，组分的确定经常会模糊或根本无法识别该组分。

与气相色谱形成鲜明对比的是，质谱检测器对混合物的检测毫无办法。如果一个单独的组分进入质谱检测器，它的质谱图可以通过各种离子化检测方法而获得。确定了该物质的质谱图通常来说就可以准确的鉴别该物质为何物并可以确定它的分子结构。显然，如果是混合物质进入质谱检测器，所获得的质谱图就会是该混合物中所有组分谱图的总和。

物质的质谱图可能会相当的复杂以至于准确的鉴别混合物中的多种组分几乎是不可能的。一方面气相色谱能够高效的分离混合物但并不善于鉴定各个组分；另一方面质谱检测器善于鉴别单一的组分却难以鉴别混合物。因此，不难理解为什么早期人们为什么致力于研究如何将两种方法联合在一起使用，组成气相色谱－质谱联用仪（GC/MS）。气相色谱－质谱联用仪能将一切可气化的混合物有效的分离并准确的定性、定量其组分。

7.1.2.3 GC-MS联用仪器的分类

按照仪器的机械尺寸，可以粗略地分为大型、中型、小型三类气质联用仪；按照仪器的性能，可以粗略地分为高档、中档、低档三类气质联用仪或研究级和常规检测级两类；

按照色谱技术，可分为气相色谱-四极杆质谱、气相色谱-离子阱质谱、气相色谱-飞行时间质谱等；

按照质谱仪的分辨率，可分为高分辨率（通常分辨率高于5000）、中分辨率（通常分辨率在1000和5000之间）、低分辨率（通常分辨率低于1000）气质联用仪。小型台式四极杆质谱检测器（MSD）的质量范围一般低于1000。四极杆质谱由于其本身固有的限制，一般GC-MS分辨率在2000以下。和气相色谱联用的飞行时间质谱（TOFMS），其分辨率可达5000左右。

7.1.3 GC-MS联用技术的应用

GC-MS联用在分析检测和研究的许多领域中起着越来越重要的作用，特别是在许多有机化合物常规监测工作中成为一种的工具。如环保领域在检测许多有机污染物，特别是一些低浓度的有机化合物，如二噁英等的标准方法就规定用GC-MS；药物研究、生产、质控以及进出口的许多环节中都要用到GC-MS；法庭科学中对燃烧、爆炸现场的调查，对各种案件现场的各种残留物的检测，如纤维、呕吐物、血迹等检验和鉴定，无一不用到GC-MS；工业生产许多领域如石油、食品、化工等行业都离不开GC-MS；甚至竞技体育运动中，用GC-MS进行的检测起着越来越重要的作用。下面简单举例介绍GC-MS的一些应用。

7.1.3.1 痕量污染物分析

随着人类社会的不断发展，科学的不断进步，人们对生存环境中的痕量污染物的分析研究越来越重视。此类样品基体复杂，所含的未知组分多，且多为痕量分析范围，GC-MS是目前环境分析中判定未知化合物及其结构的方法。已广泛应用于大气、水、土壤、沉积物、生物样品和化工产品等介质中各种有机污染物的痕量检测、鉴定和证实。

黄成等采用固相萃取一衍生化气相色谱质谱法(GC/MS)测定某制药厂污水中的雌酮(E1)、雌二醇(E2)、雌三醇(E3)和乙炔基雌二醇(EE2)4种雌激素化合物。检出限为1.8～4.7ng/L，相对标准偏差为2.3%～9.1%。目标化合物的加标回收率为(94.0±2.9%～(101±3.8)%。

DiGioia M.L.等人先用苯甲醛将PPD衍生，再用GC/MS在SIM条件下分析染发剂中的对苯二胺（PPD）转化成胺衍生物后仪器的响应度增强，从而提高了方法的灵敏度和准确度。此法使用稳定的N-苯亚甲基-4-胺为内标，线性范围为0.1～25 mg/ml，相关系数为0.99，回收率97.50%-99.06%，是检测染发剂中PPD的一个有效方法。

Aaron M.Peck和Keri C.Hornbuckle运用GC/MS检测北美洲河水中，空气中的人造麝香的含量，水中的含量为0-5ng/L,河面上空空气中的含量0-14ng/m³。

Jeffrey W.A.Charrois等运用GC/MS检测了应用水中亚硝胺类化合物（NDMA）的含量，检测限在0.4-1.6ng/L之间，和水中亚硝胺类化合物含量为0-180ng/L。

7.1.3.2 法庭科学

GC-MS用于血、尿、体液或毛发中各种（如、、等）或血、尿中挥发性有机物（如甲醇、乙醇、氯仿等）的控制，为疑难案件的鉴定和审定，提供了有力的证据。另外，运动员尿样中的检测和案件中安眠镇定药物的检测和鉴定，GC-MS也是的手段。

Chiarotti等对样品的顶空固相微萃取的处理后，气质联用对47份样品中的溶剂残留进行同时定性定量的分析，提供了的全部化学特征，成为监测各种不同的有效方法。

金永春等建立了同时检测人血液中、、司可、、、、、安定、、10种常见的气相色谱-质谱新方法，并对提取溶剂及其组成配比、体系pH值、超声振荡提取时间等样品预处理条件以及色谱柱等GC-MS分析条件进行考察和优化。

Blanchfiowe采用甲基硼酸对克伦特罗（Clenbuterol，苯胺型β2-）进行衍生，然后进行GC-MS分析，测定牛肝脏、肌肉、尿、视网膜中克伦特罗残留，方法检出限肝脏、肌肉、尿为0.05ng/g，视网膜为4.0ng/g。

7.1.3.3 天然物质和食品

各种天然物质（如中草药、植物挥发油、昆虫性信息素和各种花香）有效成分的研究，烟、酒和饮料中风味物质（如脂肪酸、醇和酯等）和有害物质（如甲醇、农药和苯并芘等）的检测，还有药物及其临床化学的检验及鉴定，GC-MS也是十分有效的手段。

罗曼等对山苍子油进行水蒸气重蒸馏1次后，用萃取2次再进行GC-MS分析，共分离出63个峰，鉴定出46个化学单体组分。

李天飞等采用索氏提取技术对烟叶末样品的挥发性成分进行提取，用GC/MS和双柱复检法对烟叶中的核心香气成分进行了定性、半定量分析，质谱共鉴定了65种香气成分。

7.1.4 GC-MS发展历程

1903年，植物学家M．S．Tswett发表了题为“一种新型吸附现象及在生化分析上的应用”的研究论文，文中次提出了应用吸附原理分离植物色素的新方法。1906年，他命名这种方法为色谱法。这种简易的分离技术，奠定了传统色谱法基础。但由于当时Tswett色谱技术分离速度慢、效率低，长时间内并没有受到当时科学界的重视。

1952年，James和Martin发明了气相色谱法，并因此获得了1952年的诺贝尔化学奖。1957年，Golay开创了毛细管气相色谱法。气相色谱法又称气相层析法，是一种采用冲洗法的色谱分离技术，特别适用于生化产品的分离纯化。气相色谱以气体作为流动相，用固体吸附剂或液体作固定相，它利用试样中各组分在色谱柱中的气相和固定液液相问的分配系数不同，当气化后的试样被载气带人色谱柱中运行时，组分就在其中的两相间进行反复多次的分配(吸附----解吸附或溶解----放出)，由于固定相对各组分的吸附或溶解能力不同，因此各组分在色谱柱中的运行速度就不同，经过一定的柱长后，试样中被分离的各组分即能达到分离。目前单纯的气相色谱应用相对要少些，一般是与其他技术联用。传统的填充柱和毛细管气相色谱各有优缺点，填充柱由于分析物在柱上的高度分散导致分辨率低，而毛细管气相色谱在分离挥发性化合物时可避免溶液干扰，但却存在取样量较少而灵敏度有所下降问题。近年来提出的由900～2000支毛细管组成的毛细管束克服了这两者的缺点。

对于复杂多组分混合物分析，单种方法是难以解决的，往往需要两种或两种以上分析方法才能有效解决。其中气相色谱、质谱灵敏度都很高，最小检测量接近，被分析样品都必须气化，所以气一质联用更为适宜，成为开发的色谱联用仪器，在所有联用技术中发展相对完善。这种技术发展较快，对未知混合组分定性鉴定、分子结构的准确判断提供了一种更加完善的手段。目前，从事有机物质分析的实验室几乎都把GC—MS作为最主要的定性确认手段之一，在很多情况下也用于定量分析。现在发展迅速的小型台式质谱仪已成为气相色谱仪的一种专用检测器——质谱检测器(MSD)。

7.1.5 GC-MS联用中的主要技术问题

7.1.5.1仪器接口

，气相色谱的入口端压力高于大气压，在高于大气压力的状态下，样品混合物的气态分子在载气的带动下，因在流动相和固定相上的分配系数不同而产生的各组分在色谱柱内的流动速度不同，使各组分分离，最后和载气一起流出色谱柱。通常色谱柱的出口端为大气压力。质谱仪中样品气态分子在具有一定真空度的离子源中转化为样品气态离子。这些离子包括分子离子和其他各种碎片离子在高真空的条件下进入质量分析器运动。在质量扫描部件的作用下，检测器记录各种按质荷比分离不同的离子其离子流强度及其随时间的变化。因此，接口技术中要解决的问题是气相色谱仪的大气压的工作条件和质谱仪的真空工作条件的联接和匹配。接口要把气相色谱柱流出物中的载气，尽可能的除去，保留或浓缩待测物，使近似大气压的气流转变成适合离子化装置的粗真空，并协调色谱仪和质谱仪的工作流量。

7.1.5.2 扫描速度

没和色谱仪联接的质谱仪一般对扫描速度要求不高。和气相色谱仪联接的质谱仪，由于气相色谱峰很窄，有的仅几秒钟时间。一个完整的色谱峰通常需要至少六个以上的数据点。这样就要求质谱仪有较高的扫描速度，才能在很短的时间内完成多次全质量范围的质量扫描，另一方面，要求质谱仪能很快地在不同的质量数之间来回转换，以满足选择离子检测的需要  。

7.2液质联用（LC-MS）

         液质联用（HLPC-MS）又叫液相色谱-质谱联用技术，它以液相色谱作为分离系统，质谱为检测系统。样品在质谱部分和流动相分离，被离子化后，经质谱的质量分析器将离子碎片按质量数分开，经检测器得到质谱图。

         液质联用体现了色谱和质谱优势的互补，将色谱对复杂样品的高分离能力，与MS具有高选择性、高灵敏度及能够提供相对分子质量与结构信息的优点结合起来，在药物分析、食品分析和环境分析等许多领域得到了广泛的应用。

7.2.1液质联用的意义

         色谱的优势在于分离，为混合物的分离提供了的选择，但其难以得到物质的结构信息，主要依靠与标准物对比来判断未知物，对无紫外吸收化合物的检测还要通过其它途径进行分析。质谱能够提供物质的结构信息，用样量也非常少，但其分析的样品需要进行纯化，具有一定的纯度之后才可以直接进行分析。因此，人们期望将色谱与质谱联接起来使用以弥补这两种仪器各自的缺点。据统计，已知化合物中约80%的化合物是亲水性强、挥发性低的有机物，热不稳定化合物及生物大分子，这些化合物的分析不适宜用气相色谱分析，只能依靠液相色谱。如果能成功地将液相与质谱联接使用，这一技术将在生物、医药、化工和环境等领域大有应用前景。为达到这一目的需要一个起“接口”作用的装置将液相与质谱联接起来。

         这个接口要解决三个主要的问题：

         （1）液相色谱中使用的流速较大，而质谱需要一个高真空环境工作；

         （2）要从流动相中提供足够的离子供质谱分析；

         （3）去除流动相中杂质对质谱可能造成的污染。

         近年来，液相色谱-质谱联用在技术及应用方面取得了很大进展，在环境、医药研究的各领域应用越来越广泛，且随着现代化的不断发展及液相色谱质谱联用技术自身的优点，液相色谱质谱联用技术必将在未来几年不断发展且发挥越来越重要的作用。

7.2.2液质联用的分析特点

         HLPC-MS除了可以分析气相色谱-质谱（GC-MS）所不能分析的强极性、难挥发、热不稳定性的化合物之外，还具有以下几个方面的优点：

         ①分析范围广，MS几乎可以检测所有的化合物，比较容易地解决了分析热不稳定化合物的难题；

         ②分离能力强，即使被分析混合物在色谱上没有分离开，但通过MS的特征离子质量色谱图也能分别给出它们各自的色谱图来进行定性定量；

         ③定性分析结果可靠，可以同时给出每一个组分的分子量和丰富的结构信息；

         ④检测限低，MS具备高灵敏度，通过选择离子检测（SIM）方式，其检测能力还可以提高一个数量级以上；

         ⑤分析时间快，HPLC-MS使用的液相色谱柱为窄径柱，缩短了分析时间，提高了分离效果；

         ⑥自动化程度高，HPLC-MS具有高度的自动化。

7.2.3“接口”技术的发展历程

         自20世纪70年代初，人们开始致力于液-质联用接口技术的研究。在开始的20年中处于缓慢的发展阶段，研制出了许多种联用接口，但均没有应用于商业化生产。直到大气压离子化（atmospheric-pressure ionization，API）接口技术的问世，液-质联用才得到迅猛发展，广泛应用于实验室内分析和应用领域。

         液-质联用接口技术主要是沿着三个分支发展的：

         （1）流动相进入质谱直接离子化，形成了连续流动快原子轰击（continuous-flow fast atom bombarment,，CFFAB）技术等；

         （2）流动相雾化后除去溶剂，分析物蒸发后再离子化，形成了“传送带式”接口（moving-belt interface）和离子束接口（particle-beam interface）等；

         （3）流动相雾化后形成的小液滴解溶剂化，气相离子化或者离子蒸发后再离子化，形成了热喷雾接口（thermo spray interface）、大气压化学离子化（atmospheric pressure chemical ionization， APCI）和电喷雾离子化（electrosprayionization，ESI）技术等。有关液相质谱的接口技术和LC-MS技术的发展，Niessen曾经进行了较为详细的综述。

7.2.3.1液体直接导入接口

         1972年，Tal'roze等人提出了直接将色谱柱出口导入质谱的思想，当时称之为毛细管入口界面。相继有许多研究组开展这方面的研究，在1980年这种液质接口已经用于商业化生产。为了避免非挥发溶剂的污染，Melera使用一个小的横隔膜对这一接口进行了改进，研制成了液体直接导入接口（direct liquid introduction interface）技术。该接口是将液相色谱的流动相沿着进样杆流动，然后通过一个直径为3～5µm的针孔，使液体射入质谱计的CI离子源中。采用传统的CI离子源可以很容易地把色谱与质谱计相连或脱开。液体直接导入接口的优点是：接口简单，造价低廉，可将非挥发性和热不稳定性的化合物温和地转化成气态，样品以溶液状态进入质谱形成了CI条件，可得到分子量信息。缺点是：分流过程中需要减少大量的流动相，使用的隔膜经常堵塞。 

7.2.3.2连续流动快原子轰击

         1985和1986年，快原子轰击（FAB）和连续流动快原子轰击（CFFAB）接口技术相继问世，并随后投入了商业化生产。快原子轰击是用加速的中性原子（快原子）撞击以甘油调和后涂在金属表面的有机物（“靶面”），导致这些有机化合物的电离。分析物经中性原子的撞击获取足够的动能以离子或中性分子的形式由靶面逸出，进入气相，产生的离子一般是准分子离子。在此基础上发展的连续流动快原子轰击技术，得到更广泛的应用。其甘油的浓度在2%～5%之间，比静态的FAB使用的甘油量少，且测定过程中“靶面”得到不断更新，其化学物理性质变化很小，同时经色谱分离后的共存物质不会同时出现在“靶面”上，因此大大降低了噪声，信噪比提高，定量分析的重现性也得到改善。

         连续流动快原子轰击接口的优点：是一种“软”离子化技术，适用于分析热不稳定、难以汽化的化合物，尤其是对肽类和蛋白质的分析在当时是的。缺点是：只能在较低的流量下工作，一般小于5µl/min，大大限制了液相柱的分离效果，流动相中使用的甘油会使离子源很快变脏，同时容易堵塞毛细管，混合物样品中共存物质的干扰也会抑制分析物的离子化，降低灵敏度。

7.2.3.3“传送带式”接口

1977年，一台商业化生产的液-质联用接口就是使用传送带式（moving-belt，MB）技术，是由Mac Fadden等人对前人研制的传送线式接口技术的改进。该接口是液相的流动相不停地由传送带送入质谱离子源，传送带可根据流动相的组成进行调整。在传送过程中，样品闪蒸解离进入离子源，在进入离子源前通过两个不同的泵和真空阀在减压条件下加热除去流动相，可以连接EI、CI 或FAB。在分析未知化合物时，可连接EI分析，获得的谱图可以在质谱数据库检索。分析大分子生物样品时，多选用FAB。在CI条件下，当样品与CI等离子体接触的状态下才可获得结果。

传送带式接口的优点是：对挥发性溶剂的传送能力高达1.5ml/min，对纯水会减少至0.5ml/min；喷射装置与传送带表面呈45度夹角时，可以改善色谱积分曲线；非挥发性缓冲液可以从传送带上除去，可以使用非挥发性缓冲溶液；对样品的收集率和富集率都较高。缺点是：传送带的记忆效应不易消除，检测信号的背景值较高，只能分析热稳定性的化合物。

7.2.3.4离子束接口

         离子束接口（particle-beaminterface，PB）是从单分散气溶胶界面（monodisperse aerosol generating interface for chromatography，MAGIC）发展来的。该接口将液相色谱的流动相在常压下借助气动雾化产生气溶胶，气溶胶扩展进入加热的去溶剂室，此时待测分子通过一个动量分离器与溶剂分离，然后经一根加热的传送管进入质谱。分析物粒子在离子源与热源室的内壁碰撞而分解，溶剂蒸发后释放出气态待测分子即可进行离子化。

         离子束接口的优点是：分析范围比热喷雾接口更宽，将电离过程与溶剂分离过程分开，更适合于使用不同的流动相，不同的分析物质；主要用于分析非极性或中等极性，分子量小于1,000的化合物，在药残、药物代谢分析、化工方面曾有许多成功的实例分析。其缺点是：灵敏度变化范围大，线性响应的浓度范围较窄，两种化合物的协同洗脱会对响应产生不可预测的效应，使用高速氦气造价太高，离子化手段仍然是电子轰击，不适于分析热不稳定的化合物。  

7.2.3.5热喷雾接口

         热喷雾接口（thermospray interface）是从20世纪70年代中期开始在美国休斯顿大学实验室立项研究，旨在解决在液相和质谱之间传送1ml/min流速水溶液流动相的难题，可使用EI和CI两种离子化源。在最初的设计中非常复杂，直到1987年后的五年内才得到突飞猛进的发展。该接口是将液相色谱的流动相通过一根电阻式加热毛细管进入一个加热的离子室，毛细管内径约0.1mm，比液体直接导入接口的取样孔大很多。毛细管的温度调节到溶剂部分蒸发的程度，产生蒸汽超声喷射，在含有水溶剂的情况下，喷射中含有夹带荷电小液滴的雾状物。由于离子室是加热的，并由前级真空泵预抽真空，当液滴经过离子源时继续蒸发变小，有效地增加了荷电液滴的电场梯度。最终使其成为自由离子而从液滴表面释放出去，通过取样锥内的小孔离开热喷雾离子源。热喷雾接口的优点是：可以减少进入质谱的溶剂量，对不挥发的分析物分子也可电离，可以接受的溶剂流量大致范围为0.5～2.5ml/min，但不允许有不挥发性缓冲溶液。缺点是：该接口技术的重现性较差，受溶剂成分、取样杆温度及离子源温度的影响；是一种软电离技术，在谱图中只有分子离子峰，碎片非常少；对分析物要求有一定的极性，流动相中要有一定量的水，对热稳定性差的化合物有明显的分解作用。

7.2.3.6电喷雾离子化技术

         电喷雾（ESI）技术作为质谱的一种进样方法起源于20世纪60年代末Dole等人的研究，直到1984年Fenn实验组对这一技术的研究取得了突破性进展。1985年，将电喷雾进样与大气压离子源成功连接。1987年，Bruins等人发展了空气压辅助电喷雾接口，解决了流量限制问题，随后台商业化生产的带有API源的液-质联用仪问世。ESI的大发展主要源自于使用电喷雾离子化蛋白质的多电荷离子在四极杆仪器上分析大分子蛋白质，大大拓宽了分析化合物的分子量范围。

ESI源主要由五部分组成：

流动相导入装置；

（2）真正的大气压离子化区域，通过大气压离子化产生离子；

（3）离子取样孔；

（4）大气压到真空的界面；

（5）离子光学系统，该区域的离子随后进入质量分析器。

在ESI中，离子的形成是分析物分子在带电液滴的不断收缩过程中喷射出来的，即离子化过程是在液态下完成的。液相色谱的流动相流入离子源，在氮气流下汽化后进入强电场区域，强电场形成的库仑力使小液滴样品离子化，离子表面的液体借助于逆流加热的氮气分子进一步蒸发，使分子离子相互排斥形成微小分子离子颗粒。这些离子可能是单电荷或多电荷，取决于分子中酸性或碱性基团的体积和数量。 

         电喷雾离子化技术的突出特点是：可以生成高度带电的离子而不发生碎裂，可将质荷比降低到各种不同类型的质量分析器都能检测的程度，通过检测带电状态可计算离子的真实分子量，同时，解析分子离子的同位素峰也可确定带电数和分子量。另外，ESI可以很方便地与其它分离技术联接，如液相色谱、毛细管电泳等，可方便地纯化样品用于质谱分析。因此在药残、药物代谢、蛋白质分析、分子生物学研究等诸多方面得到广泛的应用。其主要优点是：离子化效率高；离子化模式多，正负离子模式均可以分析；对蛋白质的分析分子量测定范围高达105以上；对热不稳定化合物能够产生高丰度的分子离子峰；可与大流量的液相联机使用；通过调节离子源电压可以控制离子的断裂，给出结构信息。

7.2.3.7大气压化学离子化技术

         大气压化学离子化（APCI）技术应用于液-质联用仪是由Horning等人于20世纪70年代初发明的，直到20世纪80年代末才真正得到突飞猛进的发展，与ESI源的发展基本上是同步的。但是APCI技术不同于传统的化学电离接口，它是借助于电晕放电启动一系列气相反应以完成离子化过程，因此也称为放电电离或等离子电离。从液相色谱流出的流动相进入一具有雾化气套管的毛细管，被氮气流雾化，通过加热管时被汽化。在加热管端进行电晕放电，溶剂分子被电离，充当反应气，与样品气态分子碰撞，经过复杂的反应后生成准分子离子。然后经筛选狭缝进入质谱计。整个电离过程是在大气压条件下完成的。

         APCI的优点是：形成的是单电荷的准分子离子，不会发生ESI过程中因形成多电荷离子而发生信号重叠、降低图谱清晰度的问题；适应高流量的梯度洗脱的流动相；采用电晕放电使流动相离子化，能大大增加离子与样品分子的碰撞频率，比化学电离的灵敏度高3个数量级；液相色谱-大气压化学电离串联质谱成为精确、细致分析混合物结构信息的有效技术。

7.2.4 质谱仪器的发展

         伴随着液-质联用接口技术的发展，质谱仪器本身也在不断发展，出现了多种类型的质谱检测器。目前比较常用的质谱仪器有：四极杆质谱仪、四极杆离子阱质谱仪、飞行时间质谱仪和离子回旋共振质谱仪等。

7.2.4.1四极杆质谱分析仪

         目前，四极杆质量滤器的应用仍然广泛。三级四极杆质谱仪的选择反应监测（selected-reaction monitoring，SRM）模式适于进行常规的和高通量的生物分析。四极杆工艺的改进和强稳定性的射频（RF）大大提高了质谱的分辨率，分辨质量数的宽度达到0.1Da，提高了分析化合物的选择性。随着对三级四极杆质谱中碰撞池的改进，出现了高压线形加速碰撞池，提高了对传送离子的能力，降低了物质间的干扰，大大提高了对多组分生物化合物的分析能力。在所有的质谱分析仪中，四极杆质谱仪的定量分析结果的准确度和精密度。

7.2.4.2四极杆离子阱质谱分析仪

         在阐明化合物的结构方面，三维的四极杆离子阱得到广泛的应用。与此相关的革新主要有基质辅助激光解吸离子化源、大气压基质辅助激光解吸离子化源、红外多光子光离解技术的发展，以及使用离子阱分析碱性加合离子与金属配位产物的研究。近些年，线形二维离子阱的生产，取得了突破性的进展。这种线形二维离子阱与三维离子阱一样可以对化合物做多级质谱分析，此外还可以积累更多的离子，提高了检测的灵敏度。在与线形加速碰撞池离子化源连接后，可大大提高灵敏度，避免小分子量碎片的干扰，得到更整洁、美观的色谱峰。

7.2.4.3飞行时间质谱分析仪

         随着基质辅助激光解吸离子化技术的出现和计算机的发展，飞行时间质谱仪在20世纪90年代得到快速发展。目前，飞行时间质谱分析仪分辨率能够达到20,000Da，测得分子的质量数准确度非常高。飞行时间质谱仪在很大程度上取代了高分辨双聚焦磁扇分析仪，但其不能有效地利用选择离子监测模式进行分析。在高分辨质谱的选择离子监测模式分析中仍然主要使用双聚焦质谱仪。为了使用分辨率高的质谱分析化合物的二级质谱图，人们尝试将飞行时间质谱与其它质谱串联使用，目前使用比较多的是四极杆-飞行时间串联质谱仪，可以帮助我们更准确地了解化合物裂解后离子碎片的质量数。

7.2.4.4傅立叶变换离子回旋共振分析仪

         许多年以来，傅立叶变换离子回旋共振质谱（Fourier-transform ion-cyclotron resonance mass spectrometry，FT-ICR-MS）在气相离子-分子反应的基础研究中成为有效的手段。该质谱与ESI离子源联接后被广泛地应用于生物大分子的研究，能够充分发挥其高分辨率和准确度的优势。基于傅立叶变换离子回旋共振池内离子的四极激发，该质谱可以选择地累积非共价键复杂化合物的离子，使其能够分析分子量非常大的生物大分子化合物，如分析分子量高达108Da的大肠杆菌噬菌体的T4DNA，成为该质谱仪发展的重要里程碑。该质谱仪通过射频脉冲消除其它离子的干扰选择性地捕获目标离子到离子回旋共振池内，也能够进行多级质谱分析。当前又有许多新的离子裂解方法应用到傅立叶变换离子回旋共振质谱仪，如碰撞诱导裂解、激光致光裂解或红外多光子光裂解、表面诱导裂解、黑体红外辐射裂解、电子捕获裂解等，又进一步改善了这种质谱仪分析的性能。

         除上面描述的常见的几种接口技术和质谱仪之外，还有其它的一些产品不断问世。近十年来，人们在液-质联用技术的研究方面已经将研究的重点转移到研制适合某种分析领域的强优势的技术，并加速产品的商业化。总之，液-质联用分析技术的发展取决于液-质联用接口技术和质谱分析仪技术的共同发展。通过合适的接口将液相色谱与质谱仪联接，会获得具有特殊分析性能的液-质联用仪器，另外通过接口将质谱与质谱进行串联，可以弥补各种质谱仪的不足，达到取长补短，协同提高的效果。

7.2.5 基体效应

7.2.5.1基体效应的来源

         LC-MS中的基质效应现象最初在1993年被发现，当改变样品基质的种类和浓度时，待测物电喷雾化质谱的响应值降低了。美国FDA2001年出版的《生物分析方法验证准则》明确提出：在LC-MS分析方法开发和验证过程中需要对基质效应进行评价。基质效应是指样品中除了待测物以外的其他基质成分对待测物测定值的影响，它源自色谱分离过程中与被测物共流出的物质对被测物离子化过程的影响，共流出干扰物可分为内源性杂质和外源性杂质。内源性杂质是指样品提取过程中同时被提取出来的有机或无机分子，当这些物质在共提取液中浓度较高，并与目标化合物共流出色谱柱进入离子源时，将严重影响目标化合物的离子化过程。外源性杂质通常易被人们忽视，但也会带来严重的基体效应。这些干扰物由样品前处理各步骤引入，文献报道的主要包括的聚合物残留、酞酸盐、去污剂降解产物、离子对试剂、有机酸等离子交换促进剂、缓冲盐或SPE小柱材料及色谱柱固定相释放的物质等。

7.2.5.2基体效应的补偿

         基体效应的存在会严重影响对待测物的定量准确度和精密度，且影响因素多变，很难被消除。近儿年来，致力于消除和补偿基质效应的研究逐渐增多，主要包括优化质谱条件，优化色谱分离体系，多步净化措施，使用内标物定量，采用基质匹配标准曲线定量，回声峰技术等。

7.2.6液质联用的应用

         随着联用技术的日趋完善，HPLC-MS逐渐成为的分析手段之一。特别是在分子水平上可以进行蛋白质、多肽、核酸的分子量确认，氨基酸和碱基对的序列测定及翻译后的修饰工作等，这在HPLC-MS联用之前都是难以实现的。HPLC-MS作为已经比较成熟的技术，目前己在生化分析、天然产物分析、药物和保健食品分析以及环境污染物分析等许多领域得到了广泛的应用。

7.2.6.1生化方面的分析中的应用

         生物体内的蛋白质、肽和核酸，都以混合物状态出现，具有强极性，难挥发性，又具有明显的热不稳定性，所以用GC-MS来分析生物大分子存在困难，需要经过深度降解，并需对降解生物作各种复杂的衍生化处理。而HPLC能分析强极性、不易挥发、高分子量及对热不稳定的化合物；MS具有高灵敏度，能在复杂基质中进行准确的化合物的优点，所以HPLC-MS作为生化分析的一个有力工具，正在得到日益的重视。研究人员利用HPLC-MS技术在生化方面己经有很多应用。

7.2.6.2天然产物分析中的应用

         利用HPLC-MS分析混合样品，和其他方法相比具有高效快速，灵敏度高，只需品进行简单预处理或衍生化，尤其适用于含量少、不易分离得到或在分离过程中易的组分。因此HPLC-MS技术为天然产物研究提供了一个高效、切实可行的分析途国内利用该技术在天然产物研究中已经有很多报道。如李丽等利用高效液相色质谱联用技术研究了朝鲜淫羊霍中的黄酮类化合物。

7.2.6.3药物和保健食品分析中的应用

         质谱作为液相色谱的检测器与紫外和二极管阵列检测器相比较，兼有鉴定功能和灵敏度高的特点。所以近些年来HPLC-MS己经成为药物分析方面的有利工具。近几年用HPLC-MS对各种药物尤其是违禁药物及其代谢产物的研究国内外有大量的文献报道，如尿中的素、抗生素、舒喘宁和血液中的、、罗呱卡因、、前列腺素EZ以及爱滋病病毒等痕量残留的分析。可以预测，随着对HPLC-MS研究的深入和该技术应用的普及，HPLC-MS技术将成为药物和保健食品中违禁成分分析中发挥更大的作用。

7.2.6.4环境分析中的应用