本实验利用液相色谱法对番石榴叶粉中鞣花酸的含量进行测定，为更广泛地开展番石榴叶开发利用提供理论和。

1材料与方法

1.1材料与试剂

番石榴叶片，鞣花酸标准品美国Fluka公司；甲醇(色谱纯)；甲醇、盐酸(均为分析纯)。

1.2仪器与设备

LC-20AD液相色谱仪(配SPD-20A紫外检测器、SIL-20A自动进样器及CTO-10A柱温箱)日本岛津公司；Universal32R高速台式冷冻离心机德国Hettich公司；Elix5超纯水仪美国Millipore公司。

1.3标准溶液的配制

准确称取鞣花酸标准品40mg，转移至100mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，得到质量浓度均为400mg/L的混标溶液，随后逐级稀释至0.5、1、5、10、20、50、100、200mg/L。

1.4色谱分析条件

色谱柱为IntersilODS-SP色谱柱(250mm×4.5mm，5μm)，柱温35°C，流动相为3%冰乙酸(A)-甲醇(B)，梯度洗脱程序：0～4minB由20%升至45%，保持6min，10～15minB由45%升至70%，15～20min升至99%，保持1min；进样体积10μL。

1.5样品处理

将所摘取的新鲜番石榴叶片分老叶、嫩叶、成熟叶，于105°C烘至质量恒定，用粉碎机打成粉，分别准确称取1.0g粉末，放入100mL单颈瓶中，加入甲醇(含0.01%HCl)30mL，于70°C搅拌回流，2h后取出冷却，用Whatman4号滤纸过滤，即得番石榴叶片粗提取液，置4°C冰箱备用。每个样品设3次重复。

2结果与分析

2.1标准曲线的制作

取各级标准溶液，进样10μL，所得的色谱图叠加如图1所示，以标样质量浓度Y/(mg/mL)为纵坐标、标样峰面积X/mV为横坐标，绘制标准溶液曲线，计算线性回归方程为Y=108711X－45231，线性范围为0.5～200mg/L，相关系数为0.9998。

2.2精密度实验

将同一番石榴叶提取液样品(样品代号2010.6.25)分装于10个样品瓶中，在同一天内重复进样5次，测定峰面积，并计算相对标准偏差(RSD)来考查其测定的精密度，得出峰面积的RSD为0.6%，保留时间的RSD为0.06%。同时将该批样品连续测定5d，得出峰面积的RSD为1.13%，说明精密度良好。

2.3回收率实验

采用加标样回收法，称取番石榴叶3份，每份样量1.0g，分别加入1000μg/mL的鞣花酸标准溶液0.5、1mL，其他均按1.5节方法进行，平行测定3次，计算回收率(回收率为用添加标样样品的测出量减去样品测出量，再除以加入的标样量，乘以99%)，结果见表3。结果表明平均回收率为95.86%～98.31%。

2.4样品分析

2.4.1色谱分离效果

按照上述色谱条件，将嫩叶、成熟叶、老叶各样品进样10.0μL进行液相色谱分析，所得样品色谱图见图2，与标准色谱图(图1)比较，可确定峰1为鞣花酸，峰1与前后相邻两峰之间的分离度均大于1.5，说明该梯度洗脱方法可以成功地分离鞣花酸和其他组分。

2. 4.2番石榴叶片中游离鞣花酸含量

从表2可看出，番石榴叶片中游离鞣花酸含量以幼嫩叶居多，成熟叶次之，而老叶中不含鞣花酸。

3讨论

番石榴叶提取物，必须采用梯度洗脱方法才能有效地分离鞣花酸和其他组分。