掌握蛋白纯化中亲和层析和凝胶层析分离的一般原理和操作方法
2026年05月04日 08:15:43
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那么下面上海金鹏分析仪器有限公司为大家简单介绍一下关于掌握蛋白纯化中亲和层析和凝胶层析分离的一般原理和操作方法。
一、目的要求：
1. 学习与掌握亲和层析和凝胶层析分离的一般原理和操作方法。
2. 了解自动化纯化设备基本组成和原理。
3. 了解亲和吸附层析琼脂糖、凝胶过滤葡聚糖的基本性质。掌握标签蛋白的基本性质和纯化原理和操作；掌握缓冲液置换和脱盐的原理和操作。
二、实验概述（如右图）
实验步骤：
1. 样品预处理：即通过超声这种细胞破碎的手段，将在大肠杆菌E.coli中表达的重组的带6个His标签的绿色荧光蛋白释放到相应的缓冲液当中，再通过离心，0.2微米滤膜过滤等去除细胞碎片和别的污染物；
2. 标签蛋白亲和层析：HisTrapTMHP crude, 1mL预装层析柱，进行亲和层析，一步就可以达到90%左右的纯度
3. 凝胶过滤层析脱盐去除咪唑：HiTrapTM Desalting 5mL预装层析柱进行脱盐，置换缓冲液
4. 电泳：对纯化过的样品的检测。
三、设备以及试剂准备（试剂均使用化学纯以上）：
1. 仪器：核酸蛋白检测仪HD系列、自动部分收集器BSZ\DBS系列、恒流泵HL系列
2. 样品：EGFP原液
3. 层析柱：HisTrap HP 1ml, 1根；HiTrap Desalting 5ml，1根
4. 层析缓冲液
名称 | 配方 | 体积 |
缓冲液A
亲和结合缓冲液
脱盐平衡和洗脱缓冲液 | 25mM 磷酸盐缓冲液,150mM NaCl, 20mM 咪唑,pH7.4 | 250ml |
缓冲液B
亲和洗脱缓冲液 | 25mM 磷酸盐缓冲液,150mM NaCl, 500mM 咪唑,pH7.4 | 100ml |
去离子水 | 脱气或负压脱气 | 500ml |
层析柱保存缓冲液 | 20%乙醇 | |
5. 注射器，烧杯，负压脱气瓶等实验室常用容器
四、实验内容
1. 仪器和实验准备：
所有缓冲液需要过0.2um膜过滤，负压脱气抽滤瓶脱气，脱气装置如图所示
样品预处理：即通过超声这种细胞破碎的手段，将在大肠杆菌E.coli中表达的重组的带6个His标签的绿色荧光蛋白释放到相应的缓冲液当中，再通过离心，0.45 微米滤膜过滤等去除细胞碎片和别的污染物；用注射器吸取大于2ml样品
将注射器内的样品从样品环3号口推入，注意不要将气泡推入样品环(如右图)。
以上就是上海金鹏分析仪器有限公司为大家整理总结关于掌握蛋白纯化中亲和层析和凝胶层析分离的一般原理和操作方法。
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