PCR是基于DNA聚合反应原理的体外技术,它依赖于PCR仪,其包括反复加热和冷却反应的循环,用于使用热稳定DNA聚合酶,引物序列和脱氧核糖核苷三磷酸进行DNA融化和酶的DNA复制。因此它可以将DNA的特定序列扩增多达十亿次,大多数PCR方法可以扩增高达10千碱基对的DNA片段。以下是建立PCR反应所需的基本组件和试剂。
1、微量离心管是一个小圆柱形塑料锥形容器,锥形底部带有卡帽,它们由聚丙烯制成,可以承受各种温度。
2、PCR仪是一种用于扩增DNA片段的仪器,有一个带孔的热块,可以插入容纳PCR反应混合物的管子,循环仪的工作原理是珀耳帖效应,它通过反转电流以预编程的方式升高和降低模块的温度,薄壁反应管允许有利的导热性以允许快速热平衡。
3、DNA模板,反应溶液应至少含有1e5到1e6目标分子。
4、引物,这些是定义待扩增序列的寡核苷酸,两个引物与DNA靶的有义链和反义链各自的游离羟基末端互补,熔化温度高于65摄氏度的底漆具有二次退火的趋势。引物中GC含量应为40至60%。
5、 MgCl2是酶的辅助因子,优化镁离子浓度是有益的,镁离子影响引物退火,和PCR产物的链解离温度,产物特异性,引物二聚体伪影的形成和酶活性和保真度,聚合酶需要结合的游离镁。
6、KCl,KCl用于反应以促进引物退火。
7、明胶或牛血清,包括高压灭菌的明胶或无核酸酶的牛血清白蛋白,以帮助稳定酶。
8、蒸馏水,使用高压蒸馏的蒸馏水,体积取决于反应。
9、脱氧环核苷三磷酸,这些是DNA构建模块,dNTP,dCTP,dATP和dGTP溶液中和至pH7.0。将初级储备溶液稀释至10mM,等分,并在零下20℃下储存。推荐每种dNTP含有1mM的工作储备液。在重复PCR循环期间,dNTP的稳定性使得在50个循环后约50%仍为dNTP。dNTP浓度在20和200微米之间对于反应是较佳的。
10、DNA聚合酶,它是一种催化反应的酶,从生长在温泉中的水生栖热菌中分离的TaqDNA聚合酶,在72摄氏度时表现较佳,90摄氏度的变性温度不会破坏其酶活性。推荐浓度的Taq聚合酶为每100uL反应,然而酶活性将随个体靶模板或引物而变化。 PCR反应建立在20到40个重复循环上,其中温度在每个循环中变化。循环从高温的单一温度步骤开始,然后在末端保持一次以进行产品延伸或短暂储存。
文章来源:上海靳澜仪器制造有限公司/pcr/index.html